JMT日本干细胞中心-骨再生医疗②

　　2.间充质干细胞的体外(in vitro)骨形成

　　如上所述，骨再生可以通过间充质干细胞和骨随本身的移植进行骨再生。另外，也可以人为地制造骨组织本身并加以应用。使用后一种方法，必须通过在体外的操作(具体来说是培养干细胞)来构建与体内存在的相同的骨结构。生物的骨组织中含有成骨细胞、骨细胞以及骨基质，同时骨组织内还存在丰富的血管和神经。也就是说，骨组织是具有三维结构的复杂组织。最近，神经以及血管的再生研究取得了进展，可以在培养皿上制作神经细胞。但是，在培养皿上构建具有神经网络功能的神经组织和具有完整管腔结构的血管很难。也就是说，通过细胞培养，构筑具有血管和神经的骨组织在现阶段是不可能的。但是，如果诱导在骨形成中起主要作用的成骨细胞和骨基质中所含的骨细胞，并且如果I型胶原蛋白和羟磷灰石沉积在骨基质上，从生物学上看，这与生体内的骨形成相匹敌。

　　通过这种培养在体外成骨需要得到间充质干细胞。间充质干细胞包含在骨髓中，可以从骨髓中分离出间充质干细胞。但是，骨髓中的间充质干细胞的数量非常少。也就是说，单纯通过分离等操作提取间充质干细胞需要大量的骨髓。因此，第一步是从骨髓中增殖间充质干细胞。有多种方法可以增殖间充质干细胞，但我们使用的方法是将从捐赠者那里采集的仅约3ml的骨髓在培养皿上播散，然后粘附在培养皿上，获得增殖的细胞。虽然这是一种非常简单的方法，但是通过这种方法可以从少量的骨髓中获得大量的间充质干细胞。将这样得到的细胞用流式细胞仪分析表面抗原，发现CD34、45等造血细胞特异性的标记物呈阴性，确认了被认为在间充质干细胞中表达较多的CD29、73,90.105的表达。下一步，将培养增殖的间充质干细胞在一种激素地塞米松、磷酸和维生素C的存在下再培养2周。在这个步骤中，间充质干细胞经过前驱细胞在培养皿上分化成成骨细胞。这个骨分化过程中，早期发现ALP，接着发现骨头的特异性骨钙蛋白的表达，最终会生成具有存在于生物内骨基质的结晶结构的氢氧磷灰石和I型胶原蛋白。此外，该骨基质内还存在骨细胞(图2)。另外，在这些步骤中看不到软骨细胞的形成。也就是说，上述生成过程中的膜性骨化可以通过间充质干细胞的培养再现，利用间充质干细胞可以在体外构建骨组织。另外，骨组织构筑在临床上使用的各种陶瓷上也可以构筑。图2的右端显示了多孔氧化铝陶瓷上的骨形成。另外，我们将这种利用培养细胞在生物体外构建骨组织的方法命名为培养骨。